Under Josefs tidlige barndom flyttet familien i begynnelsen av 1881 først til Ancona og deretter i 1888 til Napoli, da faren ble forfremmet til rådsmedlem i appellretten der. Til tross for disse avbruddene gjorde Josef det svært godt på skolen. Han mottok sin første kommunion den 27. desember 1890. Allerede som ung avla han evig kyskhetsløfte. Han gikk på middelskolen (1889-94) og gymnaset (1894-97) på skolen Vittorio Emmanuele og tok en strålende eksamen, knapt 17 år gammel. Senere i 1897 begynte han på det medisinske fakultetet på universitetet i Napoli. Det var et urolig sted på den tiden med disputter mellom de fakultetene som hadde antatt en materialistisk, positivistisk tilnærming, og de med en mer religiøs, thomistisk tilnærming, men Josef klarte å unngå fallgruvene og holdt sin kristne tro levende.
Den 21. desember samme år døde hans far. Den 2. mars 1900 mottok han fermingens sakrament. Den 14. august 1903 tok han sin doktorgradseksamen i medisin og kirurgi med strålende resultater, og hans avhandling ble publisert. I 1904 døde hans bror Albert temmelig uventet i Benevento, bare 34 år gammel. Så snart hans studier var avsluttet, begynte han på et av de lokale sykehusene, men i 1904 flyttet han til det berømte sykehuset Santa Maria del Popolo, lokalt kjent som Incurabili - de uhelbredelige. Det var her, mens han organiserte behandlingen av dem som led av rabies, at han fant sitt kall i livet.
Josef så medisinen som et kall, en form for prestedømme, og han praktiserte en form for holistisk medisin før dette kom på moten. Han sørget alltid for å sjekke pasientenes mentale og åndelige tilstand sammen med deres fysiske symptomer før han stilte en diagnose. Han hadde også en dyp følelse av ansvar for pasientene. Da vulkanen Vesuv hadde et utbrudd i april 1906, skyndte han seg til Torre del Greco, en liten landsby ved foten av vulkanen, hvor Incurabili hadde et filialsykehus for eldre invalider. Han kom dit i et livsfarlig tykt regn av aske. Han fant at de fleste ansatte allerede hadde dratt, men han ga ordre til å evakuere pasientene og arbeidet utrettelig sammen med dem av personalet som hadde blitt igjen. Straks de hadde fått den siste pasienten i sikkerhet, raste taket sammen under vekten av asken fra vulkanen. Under den voldsomme koleraepidemien i Napoli i 1911 var det bare en ting som gjaldt for ham: innsats dag og natt for alle som trengte hjelp.
Josef fant også tid til et omfattende gratisarbeid for de fattige, og han fikk venner i alle smug og stinkende bakgater i Napoli. Samtidig rakk han å fortsette avanserte medisinske studier, og i 1908 ble han professor i klinisk kjemi ved instituttet for fysiologisk kjemi. Dette medførte en del undervisning og forskning, og han publiserte minst 32 artikler i løpet av hans relativt korte, men fremragende akademiske karriere. Ved siden av sine vitenskapelige undersøkelser fortsatte han å se til pasienter på de lokale sykehusene uten betaling. Våren 1911 ble han forfremmet til direktør for Incurabili mens han samtidig også hadde det direkte ansvaret for visse avdelinger. I løpet av sitt medisinske liv ble han velgjører og sjelesørger for fattige, syke og døende.
Den 25. november 1914 døde hans mor. En tid var Josef i tvil om han skulle gifte seg, men etter lang tid i bønn kom han til at han skulle fortsette å leve i sølibat og konsentrere seg om et apostolat innen sin medisinske profesjon. Han tenkte på å bli jesuitt, men jesuittpatrene rådet ham til å fortsette sitt arbeid som lege. Den 24. mai 1915 erklærte Italia krig mot Østerrike, og Josef meldte seg frivillig og tjente som lege i første linje ved fronten. Med grad av major ble han utnevnt til leder for kontoret som hjalp soldater som var såret eller syke. Til tross for denne travle og krevende livsstilen var det sentrale hans forhold til Gud. Han mottok kommunion hver dag og gjorde sitt arbeid til en form for bønn. Regelmessig trakk han seg i lange perioder tilbake for bønn. Han hadde ikke noe ønske om å legge seg opp penger, og han behandlet alltid sine fattige pasienter gratis og betalte medisinene de trengte av egen lomme.
En episode som oppsummerer hans visjon av sin rolle, skjedde på en konferanse i februar 1927. En av de viktigste talerne var en eldre professor ved navn Bianchi, som var berømt for en fremragende karriere innen medisin og politikk, men var også en velkjent antikristen frimurer. Da forsamlingen klappet entusiastisk etter hans tale, falt han sammen på podiet. Josef, som hadde kommet til konferansen bare fordi han følte seg trukket dit av en utenforstående kraft, styrtet til for å hjelpe den døende mannen. Bianchi hadde kjent Josef som student og var klar over hans sterke kristne tro, og han tillot ham å holde sin hånd og viste sin tilslutning til Josefs ord om å angre og stole på Gud ved å trykke hånden hans før han døde.
Den berømte tenoren Enrico Caruso ble syk i 1921. Han ble feildiagnostisert og operert i Amerika og vendte tilbake til Italia svært syk. Han oppsøkte de beste legene i Roma og Napoli, men ingen kunne hjelpe den døende tenoren. Dr. Moscati ble bedt om å se på ham, og han stilte en nøyaktig diagnose. Han visste at slutten var nær, så han minnet Caruso om at mens han hadde konsultert de ulike legene, hadde han forsømt å konsultere den viktigste legen av dem alle - Jesus Kristus. Til dette svarte den berømte sangeren: «Professor, vær så snill å gjøre alt som er nødvendig». Josef tilkalte straks en prest for å gi ham de siste sakramentene, og få dager etter døde den store tenoren, bare 48 år gammel.
Josef hadde ofte nevnt at han følte at hans liv kom til å bli kort. Den 12. april 1927 hadde Josef Moscati arbeidet på sykehuset om morgenen etter å ha vært til messe som vanlig, og deretter mottok han pasienter i sitt hjem. Mellom to konsultasjoner følte han seg uvel og gikk til sitt kontor, hvor han satt seg ned i en stol. Der døde han fredelig i en alder av bare 46 år. I begravelsesmessen deltok en enorm forsamling av sørgende, og en gammel mann oppsummerte manges følelser: «Vi sørger over ham fordi verden har mistet en helgen, Napoli har mistet et eksempel på alle dyder og de syke fattige har mistet alt». Så intens var den offentlige reaksjonen på «den gode legens» død at allerede tre år senere, den 16. november 1930, ble hans jordiske levninger flyttet fra kirkegården til kirken Gesù Nuovo innenfor bygrensene.
Den 6. mars 1949 ble hans saligkåringsprosess ble igangsatt. Josef ble saligkåret den 16. november 1975 av pave Paul VI (1963-78) og helligkåret den 25. oktober 1987 av pave Johannes Paul II på Petersplassen i Roma. Det var under bispesynoden i 1987, som drøftet spørsmålet om «Legfolk i Kirken». Hans minnedag er dødsdagen 12. april, men også translasjonsdagen 16. november blir angitt. Han regnes som en eksemplarisk utøver av både tro og vitenskap. Han er den første moderne lege som har blitt helligkåret.