Den hellige Agapetus I var i følge LP romer og tilhørte gens Anicia (den samme familie som Felix II (III) og senere Gregor I den Store). Han var sønn av den fornemme presten Gordianus, som hadde blitt drept av tilhengerne til motpave Laurentius i september 502, i St. Symmachus' stormfulle dager. Under sin forgjenger Johannes II ble han utnevnt til erkediakon i Roma. Han var en kulturell mann og hadde et bibliotek med kirkefedrene i sitt familiegods på Celio-høyden, og sammen med statsmannen og forfatteren Cassiodorus (ca 490 - ca 580) planla han et kristent universitet i Roma etter modell av akademiene i Alexandria og Nisibis i Mesopotamia. Agapetus hjalp Cassiodorus med å grunnlegge hans berømte kloster i Vivarium.
Etter at Johannes II døde den 8. mai 535, ble Agapetus overdratt paveembetet den 13. mai.
Agapetus tilhørte åpenbart det flertallet som hadde støttet Dioscorus ved forrige pavevalg, og var dermed en av de prestene som motsatte seg at en pave kunne utpeke sin etterfølger. Derfor startet han sitt pontifikat med offentlig å brenne bannbullen mot Dioscorus som Bonifatius II hadde fremtvunget av geistligheten.
Agapetus' pontifikat skulle bli kort, men interessant.
Da den sterke og uavhengige paven fikk en appell fra Contumeliosus av Riez, som Johannes II hadde avsatt for vanskjøtsel av embetet, oppnevnte han nye dommere for å undersøke saken, men utfallet er ikke kjent. I juli 535 avviste han Caesarius av Arles' (død 542) søknad om tillatelse til å bruke kirkelig eiendom som hjelp for de fattige.
Etter at katolisismen igjen hadde blitt tillatt i Nord-Afrika etter keiser Justinian Is (527-65) seier over de arianske vandalene, ba biskopene om pavens kjennelse i spørsmålet om hva de skulle gjøre med konvertitter. Agapetus sto for den harde linje at arianere som hadde konvertert til ortodoksien, aldri kunne få geistlige embeter. Når det gjaldt afrikansk katolsk presteskap som søkte tilflukt i Italia for å slippe unna anklager, aksepterte paven biskopenes anmodning om at disse ikke skulle bli mottatt i Roma hvis de ikke var utstyrt med autorisasjonsbrev. Da keiser Justinian gratulerte paven med valget, ba han ham om å behandle konverterte arianere mildt, men Agapetus svarte i oktober 535 at de kirkelige lover ikke tillot en konvertert ariansk prest å fortsette i embetet.
Imens gjorde Justinian energiske forberedelser til å invadere Italia, som hadde vært et germansk kongedømme siden 476, og gjeninnlemme landet i imperiet. Etter kong Theoderik den Stores død i 526 hadde hans datter Amalasuntha, enke etter vestgoteren Eutharik, styrt som regent for sin umyndige sønn Athalarik (f. 516). Han fikk en romersk oppdragelse, noe som møtte opposisjon i den gotiske adelen. Da Athalarik døde den 2. oktober 534, valgte Amalasuntha sin fetter Theodahad til sin medregent, men han fikk henne myrdet den 5. april 535. Dette ga keiseren et påskudd, siden Amalasuntha hadde appellert til ham. I denne situasjonen påla Theodahad Agapetus å lede en delegasjon til Konstantinopel for å overtale keiseren til å frafalle sine planer. Paven gikk med på det, mye også fordi han hadde hørt at monofysittene igjen truet Konstantinopel.
På den tiden var Kirken så fattig at paven var tvunget til å pantsette kirkesølvet for å finansiere reisen. Selv om Agapetus fikk en triumfaktig mottakelse i Konstantinopel i februar 536, ble oppdraget en fiasko, for Justinian forklarte at foretaket var kommet for langt til å bli stoppet.
Keiser Justinian var kultivert og seriøs og en ortodoks hersker, men han var svak for alt som var vakkert. Han forelsket seg i den tidligere skuespillerinnen Theodora, som ikke bare hadde vakt oppmerksomhet ved sin skjønnhet, men også ved sitt lettsindige liv. Keiseren introduserte henne ved hoffet og ga henne høye titler. Han innviet henne i aristokratiske skikker og tok henne til slutt til hustru, uten å bry seg om alle innvendingene. Keiserinne Theodora utviklet seg til en sterk og verdifull støtte for keiseren, men hun hadde også den frekkhet å blande seg inn i teologi. Hun var en ivrig monofysitt, og klarte å få en av sine favoritter, Anthimos, overført fra bispesetet i Trebizond til patriarksetet i Konstantinopel. Igjen truet monofysittismen byen.
Agapetus skulle komme til å tilbringe størstedelen av sin embetstid i Konstantinopel. Han hadde langt større suksess på det kirkelige enn på det politiske planet. Han nektet kommunion med Anthimos med fordi patriarken hadde blitt ukanonisk overført fra Trebizond. Agapetus motsto trusler, løfter og tilbud om bestikkelser, og etter en offentlig diskusjon med Anthimos, overbeviste paven keiseren om at patriarken var en kjetter. Anthimos ble fjernet fra sitt embete, og Agapetus konsekrerte etterfølgeren Menas (536-52) etter at han hadde skrevet under en utvidet versjon av Hormisdas' Formula. Slik ble Agapetus den eneste pave i kirkehistorien som har konsekrert en patriark av Konstantinopel.
På Justinians ønske bekreftet Agapetus Johannes IIs erklæring som bekreftet ortodoksien til den theopaschiske formel, som Hormisdas forkastet («én av treenigheten ble korsfestet») og erklærte at keiserens tro, som den var fremkommet i det ediktet han sendte Johannes, var i samsvar med fedrenes og Den apostoliske Stols lære; han tilføyde imidlertid spisst at legfolk ikke desto mindre ikke hadde tillatelse til å preke.
Agapetus døde i Konstantinopel den 22. april 536. Men hans resolutte kamp for den kalkedonske kristologien hadde gitt nytt mot til dens tilhengere i øst, og i mai/juni ble det holdt en synode i Konstantinopel hvor geistlige medlemmer av pavens delegasjon deltok. Synoden bekreftet avsettelsen og ekskommunikasjonen av Anthimos og bannlyste andre ledende monofysitter, som Severus av Antiokia (død 538).
Det blir sagt at paven ble forgiftet av den mektige monofysittiske keiserinne Theodora. Uansett ble han spart for pave Johannes Is skjebne å vende tilbake til Italia uten å ha oppnådd noe politisk. Hans legeme ble ført tilbake til Roma i en forseglet blykiste og bisatt i St. Peterskirken den 20. september 536.
St. Agapetus hadde tidligere festdag 20. september, men blir nå minnet 22. april. Han blir også æret som hellig av østkirken med festdag 17. april.